《最后的晚餐》是达·芬奇毕生最负盛名的作品之一。在众多同类题材的绘画作品里，此画被公认为空前之作，尤其以构思巧妙、布局卓越、细部写实和严格的体面关系而引人入胜。这幅画题材取自圣经故事。犹大向官府告密，耶稣在即将被捕前，与十二门徒共进晚餐，耶稣预言“你们其中一人将出卖我”后，门徒们显得困惑、哀伤与骚动，纷纷询问耶稣：“主啊，是我吗？”这时，唯有坐在耶稣右侧（即画面正方左边第四位）的叛徒犹大惊慌地将身体往后倾，一手抓着出卖耶稣的酬劳——一个装有三十块银币的钱袋，脸部显得阴暗。
在《最后的晚餐》中，达·芬奇通过各种手法，生动地刻画了耶稣的沉静、安详，以及十二门徒各自不同的姿态、表情。画面中的人物，其惊恐、愤怒、怀疑、剖白等神态，以及手势、眼神和行为，都刻画得精细入微，惟妙惟肖，传达出丰富的心理内容。
这幅画是达·芬奇直接画在米兰一座修道院的餐厅墙上的。沿着餐桌坐着十二个门徒，形成四组，耶稣坐在餐桌的中央。他在一种悲伤的姿势中摊开了双手，示意门徒中有人出卖了他。该画420×903厘米，画面利用透视原理，使观众感觉房间随画面作了自然延伸。为了使图做得比正常就餐的距离更近，并且分成四组，在耶稣周围形成波浪状的层次，越靠近耶稣的门徒越显得激动。耶稣左手边一组是多马、老雅各、腓力。疑惑不解的多马，他怀疑的神色通过他竖起的手指表现出来，好像在问老师：“有一个人要出卖你？”和他并坐的老雅各张开两手，他试图去理解他所听到的可怕的话，他两手摊得大大的，表示惊讶。年轻的腓力则用双手掩着胸部，似乎说：“难道在怀疑我对老师有背叛行为吗？”他的脸由于爱和忠诚而显出苦恼的神情。他右手边一组的彼得、约翰和犹大三人最富有表情，也是画上的主要角色。坐在耶稣旁边的圣·约翰，头朝彼得垂着，在所有门徒中，他是耶稣最喜爱的一个。约翰像耶稣那样平静，他已经领悟了他主人的话。而犹大手中握着的钱袋，装着出卖耶稣得来的30块银币的赏钱。听了耶稣的话后，犹大情绪紧张，身子稍向后仰，右臂支在桌上，右手紧握钱袋，露出一种抑制不住的惊恐。这十三个人中，只有犹大的脸色是灰暗的。犹大的侧面阴影旁是圣·彼得，他一头银丝，向年轻的圣·约翰靠去。火性的彼得则情绪激昂，他从座位上跳起，似乎在问约翰：“叛徒是谁？”他手中已握着一把刚切了面包的刀，无意地靠近了犹大的肋部。
在耶稣右边的外面一组是由巴多罗米奥、安德烈、小雅各三人组成。巴多罗米奥好像怀疑自己的耳朵听错了，从座位上跳起来，手按在桌上，面对耶稣，情绪激动；安德烈双手张开，手指向上；夹在中间的小雅各紧张地由背后伸手到第四个人的肩上，形成两组间的联系。这三个人都面向耶稣。耶稣左手边还剩下最后三个门徒，由马太、达太和西门组成。三个人听了这骇人听闻的消息后，自发地谈论起什么来，三人的手都指向餐桌的中央。坐在正中央的耶稣摊开双手，把头侧向一边，作无可奈何的淡漠表情，他摊开双手镇定自若，和周围紧张的门徒形成鲜明的对比。
耶稣背后的门外是祥和的外景，明亮的天空在他头上仿佛一道光环。他的双眼注视画外，仿佛看穿了世间的一切炎凉。他的表情加强了两边四组人物的变化节奏感，使场面显得更富有戏剧效果。而这十二个门徒，由于各自的年龄、性格和身份不同，他们的惊讶与疑虑表情也得到细致的表现。人物之间互相呼应，彼此联系，感情不是孤立的，这是达·芬奇最重要的、也是最成功的心理描写画作。古代所谓“多样统一”的美学原则，在达·芬奇的这幅画上得到了空前有效的体现，这幅杰作的艺术成就也正在此处。
画面创造出两种强烈的光源：一盏高悬于众人左后上方的吊灯，从后侧照亮大厅，并以光勾画出众人的侧面像；耶稣正和使徒们共进圣餐，在他头部的位置，上射出一种超自然的光芒，这种实际上并不存在的光，似乎使从天而降的天使们实体化了。
这幅在格雷契寺院食堂墙壁上的宏大画面，严整、均衡、富于变化，无论从构思的完美、情节的紧凑、人物形象的典型塑造以及表现手法的纯熟上都堪称画家艺术的代表。它也是人类最优秀的绘画作品之一，由于它的问世而使达·芬奇名扬世界。
《最后的晚餐》在庄严沉闷的基调下，通过人物表情动作，将人物心理刻画得细致入微。这幅画的价值不仅体现在画作的精妙，更因为它描绘了这样一个故事而引人深思，为人性中那丑恶一面感到可耻和无奈，唤醒人们最初的善良与感动。
